Calculadora de pureza de ADN y ARN: relaciones 260/280 y 260/230
Calcula la concentración de ADN o ARN a partir de la A260 y las relaciones de pureza 260/280 y 260/230, con corrección de fondo a 320 nm, paso óptico, dilución, rendimiento, molaridad y copias por µL, una receta de dilución y una revisión de si la muestra está lista para PCR, qPCR, secuenciación, clonación o transfección.
Cómo funciona
Concentración (ng/µL) = (A260 − A320) ÷ paso (cm) × factor × dilución, con factor = 50 (ADN doble cadena), 40 (ARN), 33 (ADN cadena sencilla u oligo) µg/mL por A260 · Pureza = (A260 − A320) ÷ (A280 − A320) y (A260 − A320) ÷ (A230 − A320) · Rendimiento = concentración × volumen · PM: ADN doble cadena = pb × 617.96 + 36.04; cadena sencilla = nt × 308.97 + 18.02; ARN = nt × 320.5 + 159 · nM = ng/µL ÷ PM × 10⁶ · copias/µL = nM × 6.022 × 10⁸
Los nucleótidos absorben a 260 nm, las proteínas a 280 nm, y las sales, el fenol, la guanidina y los carbohidratos cerca de 230 nm. Una unidad de absorbancia a 260 nm con paso de 1 cm equivale a unos 50 µg/mL de ADN de doble cadena, 40 µg/mL de ARN y 33 µg/mL de ADN de cadena sencilla; los oligos varían según su secuencia, así que usa como factor propio los µg por OD del proveedor. Una A260/A280 de alrededor de 1.8 para ADN (2.0 para ARN) y una A260/A230 de 2.0 a 2.2 indican una extracción limpia. La lectura a 320 nm, donde los ácidos nucleicos no absorben, mide la turbidez o las burbujas y se resta de todas las longitudes de onda antes de calcular. Las lecturas son más confiables entre 0.1 y 1.5; por debajo, las relaciones se vuelven ruidosas. Una relación baja casi no cambia la concentración, pero puede inhibir enzimas más adelante: la PCR tolera bastante, la preparación de bibliotecas para secuenciación y la transfección no; la tabla de uso aplica metas orientativas comunes. Escribe la longitud del fragmento para obtener la concentración molar y las copias por µL, y una concentración meta para obtener la receta de dilución.
Ejemplo resuelto
Luis mide su ADN plasmídico sin diluir: A260 = 0.42, A280 = 0.23 y A230 = 0.20. La concentración es 0.42 × 50 = 21.0 ng/µL; la relación 260/280 es 1.83 (pura) y la 260/230 es 2.10 (limpia). En 50 µL tiene 1.05 µg, y para cargar 1 µg necesita 47.62 µL. Como su plásmido mide 3,000 pb, el peso molecular es 3,000 × 617.96 + 36.04 = 1,853,916 g/mol, así que 21 ng/µL equivalen a 11.33 nM, o 6.82 × 10⁹ copias por µL. Para preparar 50 µL a 10 ng/µL mezcla 23.81 µL de muestra con 26.19 µL de agua.
Fuentes: Promega — How do I determine the concentration, yield and purity of a DNA sample? · QIAGEN — dsDNA mass to moles converter (617.96 g/mol per bp + 36.04)
Preguntas frecuentes
Mi relación 260/280 es de 1.6, ¿el ADN ya no sirve?
Normalmente sigue sirviendo para PCR. Antes de secuenciación, NGS o transfección, límpialo con una columna o con precipitación con etanol. La tabla de uso te dice qué aplicaciones cumplen tus relaciones.
¿Por qué la A230 importa más en los kits de ARN?
El tiocianato de guanidina de los buffers de lisis absorbe mucho a 230 nm e inhibe la transcripción inversa, así que una 260/230 baja es una causa frecuente de que falle la RT-qPCR. Un lavado extra con etanol al 80% en la columna suele ayudar.
¿Qué es la corrección a 320 nm?
Los ácidos nucleicos y las proteínas no absorben a 320 nm, así que cualquier lectura ahí viene de turbidez, burbujas o una cubeta sucia. Restar la A320 a la A260, la A280 y la A230 elimina ese desfase; muchos equipos lo hacen solos.
¿Cómo convierto ng/µL a nM o a copias?
Divide entre el peso molecular: para ADN de doble cadena, unos 618 g/mol por par de bases. Escribe la longitud en «Más opciones» y la calculadora te da los nM y las copias por µL, útiles para ligaciones, mezclas de bibliotecas y estándares de qPCR.
¿Qué relación 260/280 indica un ARN puro?
Para ARN se espera un valor cercano a 2.0. Una 260/280 de 1.8 que sería perfecta en ADN sugiere, en una muestra de ARN, algo de contaminación con proteína o fenol.
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