Calculadora de concentración de proteínas por A280: de absorbancia a mg/mL
Convierte la absorbancia a 280 nm en concentración de proteína (mg/mL y µM) con ε (0.1%), E1% o ε molar + peso molecular, o con BSA, IgG y lisozima predefinidas, corrigiendo por dilución, paso óptico y línea base, con revisión de pureza A260/A280 y estimación de Warburg-Christian.
Cómo funciona
c (mg/mL) = (A280 − línea base) ÷ (ε₀.₁% × paso óptico) × dilución · ε₀.₁% = E1% ÷ 10 = ε molar ÷ PM · c (M) = c (g/L) ÷ PM · Warburg-Christian: c ≈ 1.55·A280 − 0.76·A260
El triptófano, la tirosina y la cistina absorben a 280 nm, así que la absorbancia de una proteína depende de cuántos de esos residuos tenga: eso es su coeficiente de extinción. Los equipos y los artículos lo expresan de tres maneras y la calculadora acepta cualquiera: ε (0.1%) es la absorbancia de una solución de 1 mg/mL, E1% (el ajuste del NanoDrop) es la absorbancia de una solución de 10 mg/mL, y el ε molar en M⁻¹cm⁻¹ que da ProtParam necesita el peso molecular. Las opciones de BSA, IgG y lisozima usan sus valores estándar. La regla genérica de «1 A280 = 1 mg/mL» puede fallar hasta en 50% con proteínas muy ricas o muy pobres en aromáticos, como muestra la tabla comparativa. Las lecturas son más confiables entre 0.1 y 1.5 aproximadamente; por encima, diluye y escribe el factor de dilución. Puedes restar una lectura de línea base a 320 o 340 nm para eliminar la dispersión por agregados, y una A260 opcional te da la relación 260/280 (unos 0.57 en proteína pura) y la estimación de Warburg-Christian, que corrige de forma aproximada la contaminación con ácidos nucleicos.
Ejemplo resuelto
Sofía mide una solución de BSA y obtiene A280 = 0.65 en una celda de 1 cm, sin diluir. Con ε (0.1%) = 0.667 la concentración es 0.65 ÷ 0.667 = 0.975 mg/mL, es decir, 0.975 ÷ 66,430 = 14.7 µM. Con el valor genérico de 1.0 le habría dado 0.650 mg/mL, un tercio menos. Si además mide A260 = 0.40, la relación es 0.62 y la estimación de Warburg-Christian es 1.55 × 0.65 − 0.76 × 0.40 = 0.70 mg/mL.
Fuentes: Thermo Fisher — Spectrophotometric determination of protein concentration at 280 nm (technical note) · ExPASy ProtParam documentation (extinction coefficients)
Preguntas frecuentes
¿Cómo convierto el ε molar en ε (0.1%) o E1%?
ε (0.1%) = ε molar ÷ peso molecular, y el E1% es diez veces ese valor. Para la BSA: 43,824 ÷ 66,463 = 0.66, así que el E1% ≈ 6.6. También puedes elegir la opción molar y dejar que la calculadora haga la conversión.
¿Qué paso óptico uso con NanoDrop?
El NanoDrop mide con 1.0 o 0.2 mm (o ajusta el paso solo), pero reporta la absorbancia normalizada a 10 mm, así que aquí usa 1 cm. En un lector de placas escribe el paso real (a menudo 0.2 a 0.6 cm para 100 a 200 µL en una placa de 96 pozos).
¿Por qué la regla de 1 mg/mL = 1.0 no siempre funciona?
Porque cada proteína tiene una cantidad distinta de triptófano y tirosina. Una IgG da cerca de 1.37 por mg/mL y la BSA solo 0.667, así que el valor genérico puede desviarse bastante; la tabla bajo los resultados muestra cuánto.
¿En qué rango de absorbancia es confiable la lectura?
Aproximadamente entre 0.1 y 1.5 en una celda de 1 cm. Por debajo de 0.1 dominan el ruido y el blanco; por encima de 1.5 la luz parásita hace que la lectura deje de ser lineal. Diluye las muestras altas y escribe el factor de dilución.
¿Qué indica la relación A260/A280?
La proteína pura da unos 0.57; los ácidos nucleicos absorben aproximadamente el doble a 260 que a 280, así que una relación más alta significa que hay ADN o ARN inflando la A280. La fórmula de Warburg-Christian (1.55·A280 − 0.76·A260) es una corrección aproximada.
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