Calculadora de coeficiente de extinción molar de proteínas a 280 nm
Predice el coeficiente de extinción molar (ε₂₈₀) de una proteína a partir de su secuencia o de sus triptófanos, tirosinas y cistinas (Pace/ProtParam o Gill y von Hippel), con peso molecular, Abs 0.1%, valores oxidado y reducido, y la concentración a partir de la A280.
Cómo funciona
ε₂₈₀ = 5,500 × nTrp + 1,490 × nTyr + 125 × nCistinas (M⁻¹cm⁻¹, Pace 1995; Gill y von Hippel: 5,690 / 1,280 / 120) · PM = Σ masas de los residuos + 18.02 · A280 (1 mg/mL) = ε ÷ PM · c = A ÷ (ε × l) × dilución
A 280 nm, la absorbancia de una proteína viene casi por completo del triptófano, la tirosina y las cisteínas unidas por puentes disulfuro (cistinas), así que contando esos residuos se predice el coeficiente de extinción con un error de pocos puntos porcentuales. Si pegas la secuencia, la calculadora cuenta esos residuos y obtiene el peso molecular promedio a partir de las masas de los residuos, igual que ProtParam de ExPASy; también puedes escribir tú los conteos y el peso. Como ProtParam, cuando hay cisteínas da dos valores: uno suponiendo que todos los pares forman puentes disulfuro (proteína plegada y oxidada) y otro suponiendo que todas están reducidas (con DTT o TCEP); además puedes indicar el número exacto de puentes. Al dividir ε entre el peso molecular obtienes la absorbancia de una solución de 1 mg/mL (ε 0.1%), el dato que piden la mayoría de los espectrofotómetros; el E1% es diez veces ese valor. Los coeficientes por defecto son los de Pace y colaboradores (1995); el conjunto más antiguo de Gill y von Hippel se ofrece para comparar. Las cisteínas libres no aportan nada, mientras que la contaminación con ácidos nucleicos y la dispersión de luz inflan la lectura.
Ejemplo resuelto
Luis trabaja con BSA: 2 triptófanos, 20 tirosinas y 17 puentes disulfuro. ε₂₈₀ = 11,000 + 29,800 + 2,125 = 42,925 M⁻¹cm⁻¹, cerca del valor aceptado de 43,824; con un peso molecular de 66,430 Da, una solución de 1 mg/mL da 0.646. Si pega la secuencia de la lisozima de huevo (129 residuos, 6 Trp, 3 Tyr y 8 Cys) obtiene 33,000 + 4,470 + 4 × 125 = 37,970 M⁻¹cm⁻¹ oxidada (37,470 reducida), un peso molecular de 14,313.14 Da y una Abs 0.1% de 2.653, igual que ProtParam.
Fuentes: ExPASy ProtParam documentation · Pace CN et al. (1995) How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Science 4:2411–2423 · Gill SC, von Hippel PH (1989) Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal Biochem 182:319–326
Preguntas frecuentes
¿Uso la forma reducida u oxidada?
Usa el valor oxidado (todas las cisteínas emparejadas) para una proteína plegada con puentes disulfuro, el reducido en buffers con DTT, TCEP o β-mercaptoetanol, y la opción de número conocido si sabes cuántos puentes tiene la estructura. La diferencia es de solo 125 M⁻¹cm⁻¹ por puente.
¿El buffer influye en la lectura?
Sí. Haz el blanco con exactamente el mismo buffer: el Tris, el imidazol, los detergentes y los nucleótidos absorben cerca de 280 nm.
¿Qué pasa si mi proteína no tiene triptófano?
El coeficiente dependerá solo de las tirosinas y cistinas y será bajo, por lo que el error relativo crece a 10% o más. En ese caso conviene medir la concentración con otro método, como Bradford o BCA, o determinar ε experimentalmente.
¿Incluyo el péptido señal o las etiquetas?
Pega la secuencia de la proteína tal como está en el tubo: sin el péptido señal si se corta, pero con la etiqueta de histidinas o la proteína de fusión si siguen unidas, porque sus triptófanos y tirosinas también absorben.
¿Cómo paso de concentración molar a mg/mL?
Multiplica la concentración molar por el peso molecular. Por ejemplo, 15.1 µM de una proteína de 66,430 Da son 15.1 × 10⁻⁶ × 66,430 ≈ 1.0 mg/mL. La calculadora muestra ambos valores.
Calculadoras relacionadas
Herramienta con fines de enseñanza y planificación: confirma los resultados con el protocolo de tu laboratorio y la documentación de tus equipos.