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Calculadora de Tm de primers: temperatura de fusión con la regla de Wallace

Calcula la temperatura de fusión (Tm) de un primer o cebador para PCR con la regla de Wallace a partir de sus bases A+T y G+C, junto con su contenido de GC.

Bases A + T

Bases G + C

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Cómo funciona

Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C) [regla de Wallace o regla 2+4, en °C]

La regla de Wallace es la forma rápida de estimar la temperatura de fusión de oligonucleótidos cortos, de unas 14 a 20 bases. Suma 2 °C por cada A o T y 4 °C por cada G o C, porque los pares G–C se unen con tres puentes de hidrógeno y los A–T solo con dos: por eso los primers ricos en GC se mantienen hibridados a temperaturas más altas. No toma en cuenta la concentración de sales ni la del primer, así que úsala como punto de partida y no como el valor termodinámico del modelo de vecinos más cercanos.

Ejemplo resuelto

Luis diseña un cebador de 20 bases con 10 A/T y 10 G/C. Su Tm es 2 × 10 + 4 × 10 = 20 + 40 = 60 °C y su contenido de GC es 10 ÷ 20 = 50%. Si cambia a un primer de 15 bases con 5 A/T y 10 G/C, la Tm queda en 2 × 5 + 4 × 10 = 50 °C, con 66.7% de GC.

Fuentes: Wallace rule — Wikipedia

Preguntas frecuentes

¿Cuándo es confiable la regla de Wallace?

Funciona mejor con primers de unas 14 a 20 bases y concentraciones de sal estándar. Para oligos más largos o trabajo fino, usa un modelo de vecinos más cercanos que considere la energía de apilamiento, las sales y la concentración del primer.

¿Por qué la G y la C valen el doble?

La guanina y la citosina forman tres puentes de hidrógeno, mientras que la adenina y la timina solo forman dos. Ese enlace extra hace más estable el par G–C, así que cada uno suma 4 °C en lugar de 2 °C.

¿Cómo se calcula la temperatura de alineamiento a partir de la Tm?

La temperatura de alineamiento (annealing) suele fijarse entre 3 y 5 °C por debajo de la Tm más baja de tus dos primers, para que se unan de forma específica sin despegarse.

¿Qué contenido de GC debe tener un buen primer?

Lo habitual es buscar entre 40% y 60% de GC. Así la Tm queda en un rango práctico y se reducen las uniones inespecíficas o las estructuras secundarias.

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Esta calculadora tiene fines informativos. Verifica los resultados importantes antes de tomar decisiones.