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Calculadora de temperatura de alineamiento para PCR: Ta a partir de la Tm de tus primers

Calcula la temperatura de alineamiento (hibridación) de tu PCR a partir de la Tm de los primers directo y reverso, restando unos grados a la Tm más baja.

Tm del primer directo (forward)

Tm del primer reverso (reverse)

Grados por debajo de la Tm más baja

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Cómo funciona

Ta = mín(Tm directo, Tm reverso) − margen · margen ≈ 3–5 °C

En el paso de alineamiento (o hibridación) de la PCR, la temperatura debe ser lo bastante baja para que se unan los dos primers, así que se calcula a partir de la menor de sus temperaturas de fusión (Tm). Fijar la Ta unos grados por debajo de esa Tm da una unión estable y específica; si bajas demasiado aparecen uniones inespecíficas y bandas de más, y si subes demasiado los primers pueden no alinearse en absoluto. Los primers con Tm parecidas (a uno o dos grados de diferencia) son los que alinean de forma más limpia.

Ejemplo resuelto

Luis diseñó un primer directo con Tm de 60 °C y uno reverso con Tm de 58 °C. La Tm más baja es 58 °C y la diferencia entre ambos es de 2 °C. Con un margen de 5 °C, la temperatura de alineamiento queda en 58 − 5 = 53 °C; con un margen de 2.5 °C sería 55.5 °C.

Fuentes: PCR annealing — Wikipedia

Preguntas frecuentes

¿Por qué la Ta se basa en la Tm más baja?

Porque los dos primers tienen que alinearse en el mismo paso. Tomar la Tm más baja asegura que el primer más débil también se una; una temperatura ajustada a la Tm más alta lo dejaría fuera del molde.

¿Qué hago si las Tm de mis primers son muy distintas?

Una diferencia grande (más de unos 5 °C) hace difícil encontrar una temperatura que sirva para ambos. Rediseña uno de los primers para acercarlas o usa una PCR en gradiente de temperatura para encontrar el mejor punto intermedio.

¿Siempre sirve restar un margen fijo?

No: la regla de 3 a 5 °C es solo un punto de partida. Optimízala en la práctica con un gradiente, porque la polimerasa, el buffer y el molde cambian la temperatura de alineamiento ideal.

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