Calculadora de viabilidad celular: porcentaje de células vivas con azul de tripano
Calcula el porcentaje de viabilidad celular con el conteo de vivas y muertas en azul de tripano, con las concentraciones de un contador automático o con un ensayo en placa de MTT, MTS o resazurina, más las células viables y muertas por mL, el total de viables, un intervalo de confianza del 95%, el volumen de siembra y la estadística de las réplicas.
Cómo funciona
Viabilidad (%) = vivas ÷ (vivas + muertas) × 100 · células/mL = células contadas ÷ cuadros × dilución × 10⁴ · células viables totales = células viables/mL × volumen · Ensayo en placa: viabilidad (%) = (tratado − blanco) ÷ (control − blanco) × 100; inhibición = 100 − viabilidad · Intervalo del 95%: puntuación de Wilson sobre vivas ÷ contadas
El azul de tripano solo atraviesa las membranas dañadas, así que las células que se tiñen de azul están muertas y las claras siguen vivas. La viabilidad es la proporción de vivas entre todas las contadas. Cada cuadro grande de la cámara de Neubauer contiene 0.1 µL, así que el conteo por cuadro por la dilución por 10⁴ da las células por mililitro; si mezclas 1:1 con azul de tripano, la dilución es 2. Si un contador automático o un citómetro de flujo te dio las concentraciones de vivas y muertas, elige «Concentraciones»: el menú de unidades las acepta en células/mL o en × 10⁴, 10⁵ o 10⁶. Para un ensayo en placa de 96 pozos con MTT, MTS, XTT, resazurina o ATP, pega las lecturas de los pozos tratados y del control sin tratar y el blanco del medio: la viabilidad es la señal tratada, corregida por el blanco, como porcentaje del control, con la dispersión entre réplicas. Los conteos tienen error de muestreo: con 200 células contadas, el intervalo del 95% para una viabilidad de 92% va de 87.4 a 95.0%, y la calculadora lo muestra para que sepas si una pequeña caída es real. Cuenta en los primeros minutos después de mezclar, porque el colorante tiñe poco a poco también a las células vivas, y busca contar entre 100 y 400 células en total.
Ejemplo resuelto
Sofía cuenta 184 células vivas y 16 azules en 4 cuadros grandes, con una dilución 1:1 en azul de tripano (factor 2). Viabilidad: 184 ÷ 200 = 92.0%, un cultivo sano, con un intervalo del 95% de 87.4 a 95.0%. Células viables: 184 ÷ 4 × 2 × 10⁴ = 0.92 × 10⁶ por mL, así que en sus 10 mL tiene 9.2 × 10⁶. Para sembrar 1 × 10⁶ células viables toma 1.09 mL. En un ensayo en placa, pozos tratados que leen 0.62, 0.65 y 0.60 frente a controles de 0.95, 0.98 y 0.93 con un blanco de 0.05 dan (0.623 − 0.05) ÷ (0.953 − 0.05) = 63.5% de viabilidad y 36.5% de inhibición.
Fuentes: Thermo Fisher Gibco — Trypan blue exclusion protocol · AAT Bioquest — Trypan blue dye exclusion assay
Preguntas frecuentes
¿Qué porcentaje de viabilidad celular se considera bueno?
Para la mayoría de los ensayos, subcultivos y transfecciones se busca más de 90%; los cultivos sanos en fase logarítmica, la citometría de flujo y el trabajo con células individuales piden al menos 95%. Después de descongelar es normal tener entre 70 y 90% en el primer pase.
¿Cómo calculo el porcentaje de viabilidad de un ensayo de MTT?
Resta el blanco (medio con reactivo, sin células) a todas las lecturas, divide el promedio tratado entre el promedio del control sin tratar y multiplica por 100. Elige «Ensayo en placa», pega las lecturas de las réplicas y la calculadora te da la viabilidad, la inhibición y la dispersión.
¿Qué tan exacto es un conteo de viabilidad con azul de tripano?
Es una muestra, así que tiene error de conteo: con 100 células el intervalo del 95% es de unos ±6 puntos porcentuales a 90% de viabilidad, y con 400 células de unos ±3. Cuenta más cuadros o las dos cámaras cuando unos cuantos puntos importan.
¿Por qué el contador automático me da un número distinto?
Los contadores automáticos separan los restos y los grumos por tamaño con criterios propios, así que no coinciden exactamente con el conteo manual. Usa un solo método durante todo el experimento y escribe las concentraciones del contador en «Concentraciones».
¿Por qué un resultado de MTT puede diferir del de azul de tripano?
El MTT y los ensayos parecidos miden actividad metabólica, mientras que el azul de tripano mide la integridad de la membrana. Un tratamiento que frena el metabolismo baja la señal del MTT sin matar células, y las células que están muriendo pueden excluir el colorante por un tiempo: las dos cifras responden preguntas distintas.
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