Calculadora de la ley de Beer-Lambert: absorbancia, ε y concentración
Resuelve la ley de Beer-Lambert A = ε·l·c para la concentración, la absorbancia, la absortividad molar o el paso óptico, con menús de unidades (nM a M, µm a m, M⁻¹ o mM⁻¹ cm⁻¹). Ingresa absorbancia, % de transmitancia o I e I₀, resta un blanco, corrige por dilución y obtén la concentración en masa y la comprobación del intervalo lineal.
Cómo funciona
A = ε × l × c · c = A ÷ (ε × l) · ε = A ÷ (l × c) · l = A ÷ (ε × c) · A = −log₁₀(%T ÷ 100) = log₁₀(I₀ ÷ I) · %T = 100 × 10^(−A) · c de la muestra = c en la celda × dilución · g/L = M × masa molar
Cuando la luz atraviesa una solución, cada capa delgada absorbe la misma fracción de la luz que le llega, así que la intensidad cae de forma exponencial con la distancia y con el número de moléculas que absorben. Al sacar el logaritmo se obtiene la absorbancia, que es simplemente proporcional al paso óptico y a la concentración; el coeficiente de absortividad molar ε indica qué tan fuerte absorbe una molécula a cierta longitud de onda. Elige la incógnita (concentración, absorbancia, ε o paso óptico) y escribe las otras tres en las unidades que tengas: concentraciones de nM a M, pasos ópticos en µm, mm, cm o m, y ε por M o por mM. La lectura puede ser una absorbancia, un porcentaje de transmitancia o las intensidades I e I₀, y puedes restar un blanco y aplicar un factor de dilución. Si agregas la masa molar obtienes mg/mL y la absorbancia específica (ε 0.1% y E1%). La relación solo se cumple en soluciones diluidas y con luz casi monocromática: con absorbancias altas llega muy poca luz al detector y la luz parásita curva la gráfica, así que conviene diluir las lecturas mayores de 1.5 en vez de confiar en ellas. La tabla muestra cuánto leería la misma muestra en otras celdas.
Ejemplo resuelto
Luis mide una solución de NADH y obtiene A340 = 0.450 en una celda de 1 cm. Con ε = 6,220 M⁻¹cm⁻¹, la concentración es 0.450 ÷ 6,220 = 7.235 × 10⁻⁵ M = 72.35 µM, y pasa 100 × 10^(−0.45) = 35.5% de la luz. Con la masa molar del NADH, 709.4 g/mol, son 72.35 µM × 709.4 = 51.3 µg/mL. Si hubiera diluido la muestra 1:10 antes de medir, la original estaría a 723.5 µM. En sentido inverso, 43.3 µM de un colorante con ε = 8,400 M⁻¹cm⁻¹ en una celda de 1 cm debería dar A = 8,400 × 1 × 4.33 × 10⁻⁵ = 0.364.
Fuentes: IUPAC Gold Book — Beer–Lambert law · IUPAC Gold Book — absorbance
Preguntas frecuentes
¿Cómo paso de transmitancia a absorbancia?
A = −log₁₀(%T ÷ 100), o log₁₀(I₀ ÷ I) con las intensidades. Un 10% de T equivale a A = 1, un 1% a A = 2 y un 50% a A = 0.301. Elige «Solo A ↔ %T» para una conversión rápida con tabla de referencia.
¿Dónde encuentro el valor de ε de mi compuesto?
En las fichas técnicas del proveedor, en la literatura o midiéndolo tú con una serie de diluciones de concentración conocida: es la pendiente de A contra c con 1 cm de paso óptico. Elige «ε» para obtenerlo a partir de un estándar. En proteínas se calcula con el contenido de triptófano, tirosina y cistina (por ejemplo, con ExPASy ProtParam).
¿M⁻¹cm⁻¹ y L·mol⁻¹·cm⁻¹ son lo mismo?
Sí: M es mol/L, así que M⁻¹cm⁻¹ = L·mol⁻¹·cm⁻¹. Los valores por mM (mM⁻¹cm⁻¹, como 6.22 para el NADH) son 1,000 veces menores; elige esa unidad y la calculadora hace la conversión.
¿Puedo usar un lector de placas?
Sí, pero el paso óptico es la altura del líquido, no 1 cm: suele ser de 0.3–0.6 cm con 100–200 µL en una placa de 96 pozos. Muchos lectores lo corrigen con el pico del agua a 977 nm. También puedes calcular el paso óptico con un estándar de concentración conocida.
¿En qué rango de absorbancia conviene medir?
Aproximadamente entre 0.1 y 1.0 en la mayoría de los equipos. Por debajo de 0.1 dominan el ruido y el blanco; por encima de 1.5 la luz parásita aplana la respuesta. Diluye las muestras concentradas y escribe el factor de dilución para que la calculadora reporte la concentración original.
¿Qué es el blanco y por qué se mide?
Es la celda con el mismo disolvente o buffer pero sin el analito. Se usa para poner la absorbancia en cero, de modo que solo midas lo que absorbe tu compuesto y no la celda ni el disolvente. Si tu equipo no se puso en cero, escribe la absorbancia del blanco para restarla.
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Fórmulas estándar de laboratorio y convenciones de protocolos de referencia (Sambrook, Bio-Rad, Thermo Fisher). Sigue el manual de tu kit o equipo cuando difiera y valida con controles: esta herramienta no sustituye la capacitación ni los procedimientos de seguridad del laboratorio.