🧬

Calculadora de eficiencia de qPCR (pendiente de la curva estándar)

Calcula la eficiencia de amplificación de cebadores de qPCR a partir de una curva estándar de diluciones o de su pendiente: E = 10^(−1/pendiente) − 1, con R², intercepto y el criterio del 90–110%.

Datos

Factor de dilución entre puntos

Ct: punto más concentrado

Ct: dilución 2

Ct: dilución 3

Ct: dilución 4

Ct: dilución 5

Pendiente (Ct frente a log10 de la cantidad)

Cargando calculadora…

Cómo funciona

x = log10(cantidad relativa) de cada dilución, y = Ct · pendiente = Σ(x − x̄)(y − ȳ) ÷ Σ(x − x̄)² · factor de amplificación = 10^(−1/pendiente) · eficiencia (%) = (10^(−1/pendiente) − 1) × 100 · una pendiente de −3.32 = 100%

Si el producto de PCR se duplica exactamente en cada ciclo, una dilución 1:10 retrasa el Ct en log2(10) = 3.32 ciclos, así que la gráfica del Ct frente al log10 de la cantidad inicial tiene una pendiente de −3.32 y la eficiencia es del 100%. Prepara una dilución seriada del molde (cinco puntos de una serie 1:10 o 1:2, por réplica), ajusta la recta y convierte su pendiente. Las guías MIQE esperan eficiencias del 90–110% con R² mayor de 0.98; los valores por encima del 100% suelen indicar inhibición en las muestras más concentradas o dímeros de cebadores, no una PCR «superior al 100%».

Ejemplo resuelto

Una serie 1:10 da valores Ct de 15.12, 18.41, 21.83, 25.14 y 28.49. La pendiente ajustada es −3.347 con R² 1.0000, así que el factor de amplificación es 10^(1/3.347) = 1.990 y la eficiencia es del 99.0%: aceptable.

Fuentes: Bustin SA et al. The MIQE guidelines. Clin Chem 2009;55:611–22 · Thermo Fisher — Efficiency of real-time PCR

Preguntas frecuentes

¿Cuál es una buena eficiencia de qPCR?

Entre 90% y 110% (pendiente entre −3.58 y −3.10 aproximadamente), con R² mayor de 0.98. Las eficiencias del gen diana y del de referencia deben diferir menos de un 5–10% para usar el método 2^−ΔΔCt.

¿Por qué mi eficiencia supera el 100%?

Casi siempre por inhibidores de la PCR en las muestras más concentradas (retrasan sus Ct y aplanan la curva), por señal de dímeros de cebadores con SYBR Green o por errores de pipeteo en la serie de diluciones. Quita el punto más concentrado y vuelve a calcular.

¿Cómo calculo la eficiencia con una serie de diluciones 1:2?

Escribe 2 como factor de dilución. Con eficiencia perfecta, cada dilución 1:2 sube el Ct en 1 ciclo, así que la pendiente frente al log10 de la cantidad sigue siendo −3.32.

¿Cuántos puntos de dilución necesito?

Al menos tres, pero cinco o más puntos que cubran el rango de Ct esperado, cada uno por triplicado, dan una pendiente mucho más fiable.

Calculadoras relacionadas

Calculadora delta delta Ct (fold change en qPCR)

Calcula la expresión génica relativa a partir de valores Ct de qPCR con el método 2^−ΔΔCt de Livak: ΔCt, ΔΔCt, cambio de expresión (fold change) y log2, con eficiencia de amplificación opcional.

Calculadora de amplificación por PCR

Calcula cuántas copias de ADN produce una PCR a partir de las copias iniciales, el número de ciclos y la eficiencia de amplificación, con el factor de amplificación.

Calculadora de master mix para PCR

Prepara un master mix de PCR para cualquier número de reacciones: µL de tampón, dNTP, cebadores, MgCl₂, polimerasa y agua por reacción y para toda la mezcla, con volumen extra por pérdidas de pipeteo.

Calculadora de diluciones seriadas

Calcula la concentración de cada tubo en una dilución seriada a partir de la concentración inicial, el factor de dilución por paso y el número de pasos.

Calculadora de regresión lineal

Ajusta una recta de mínimos cuadrados y = a + bx a tus datos X e Y y obtén la pendiente, la ordenada al origen, la correlación r y el coeficiente r².

Esta calculadora tiene fines informativos. Verifica los resultados importantes antes de tomar decisiones.