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Calculadora delta delta Ct (fold change en qPCR)

Calcula la expresión génica relativa a partir de valores Ct de qPCR con el método 2^−ΔΔCt de Livak: ΔCt, ΔΔCt, cambio de expresión (fold change) y log2, con eficiencia de amplificación opcional.

Ct del gen diana: muestra tratada

Ct del gen de referencia: muestra tratada

Ct del gen diana: muestra control

Ct del gen de referencia: muestra control

Eficiencia de amplificación

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Cómo funciona

ΔCt = Ct(diana) − Ct(referencia) · ΔΔCt = ΔCt(tratada) − ΔCt(control) · cambio de expresión = 2^(−ΔΔCt), o (1 + E)^(−ΔΔCt) con eficiencia E · log2 del cambio = −ΔΔCt × log2(1 + E)

El método comparativo de Ct de Livak y Schmittgen (2001) convierte los ciclos umbral de la PCR cuantitativa en expresión relativa. Restar el Ct del gen de referencia (constitutivo) al Ct del gen diana normaliza la cantidad de ADNc de cada pocillo; restar el ΔCt de la muestra control al de la muestra tratada da el ΔΔCt. Como cada ciclo duplica el producto, un ΔΔCt de −1 significa el doble de diana. El método supone que ambos genes amplifican con una eficiencia parecida y cercana al 100%; usa el promedio de las réplicas técnicas y haz la estadística con los ΔCt, no con los cambios de expresión.

Ejemplo resuelto

Tratada: Ct de la diana 24.5 y de la referencia 18.0, así que ΔCt = 6.50. Control: Ct de la diana 26.0 y de la referencia 18.2, así que ΔCt = 7.80. ΔΔCt = 6.50 − 7.80 = −1.30 y el cambio de expresión es 2^1.30 = 2.46: la diana está sobreexpresada unas 2.5 veces (log2 del cambio 1.30).

Fuentes: Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^−ΔΔCT method. Methods 2001;25:402–8 · Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res 2001;29:e45

Preguntas frecuentes

¿Qué significa un ΔΔCt negativo?

Que la diana aparece antes (Ct menor) en la muestra tratada tras normalizar, así que es más abundante: ΔΔCt = −1 significa 2 veces más y −2, 4 veces más. Un ΔΔCt positivo indica subexpresión: +1 da un cambio de 0.5.

¿Cómo informo una subexpresión?

Un cambio de 0.25 suele expresarse como −4 veces (el inverso negativo) o como log2 del cambio de −2. Los valores log2 son simétricos alrededor de cero y son mejores para gráficas y estadística.

¿Cuándo no puedo usar el método 2^−ΔΔCt?

Cuando el gen diana y el de referencia amplifican con eficiencias claramente distintas (deberían diferir menos de un 5–10%) o cuando el propio gen de referencia cambia con el tratamiento. En ese caso usa el método de Pfaffl con corrección de eficiencia o varios genes de referencia validados.

¿Promedio los Ct o los cambios de expresión?

Promedia primero los Ct de las réplicas técnicas y luego calcula el ΔCt de cada réplica biológica. Haz la estadística con los ΔCt (o ΔΔCt), que siguen una distribución normal, y convierte a cambio de expresión solo para presentar los datos.

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