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Calculadora de master mix para PCR

Prepara un master mix de PCR para cualquier número de reacciones: µL de tampón, dNTP, cebadores, MgCl₂, polimerasa y agua por reacción y para toda la mezcla, con volumen extra por pérdidas de pipeteo.

Número de reacciones

Extra por pérdidas de pipeteo

Volumen de reacción

Tampón stock

Tampón final

dNTP stock (cada uno)

dNTP final (cada uno)

Cebador stock (cada uno)

Cebador final (cada uno)

MgCl₂ stock

MgCl₂ extra final (0 = nada)

Polimerasa stock

Polimerasa por reacción

Molde por reacción (se añade aparte)

Cargando calculadora…

Cómo funciona

volumen de cada componente = volumen de reacción × concentración final ÷ concentración stock (dNTP: µM ÷ (mM × 1,000)) · polimerasa (µL) = unidades ÷ (U/µL) · agua = volumen de reacción − componentes − molde · master mix = (volumen de reacción − molde) × reacciones × (1 + extra %)

Un master mix reúne todo lo que es igual en cada tubo de PCR (tampón, dNTP, cebadores, magnesio extra, polimerasa y agua) para pipetear una sola vez y repartir volúmenes iguales, lo que reduce los errores de pipeteo y la contaminación. Cada volumen sigue C₁V₁ = C₂V₂. Una reacción típica con Taq usa tampón 1X (1.5 mM de MgCl₂), 200 µM de cada dNTP, 0.1–1 µM de cada cebador y 1.25 unidades de Taq por cada 50 µL (protocolo M0273 de NEB). Preparar un 10% extra cubre el líquido que se queda en las puntas; el molde se añade al final a cada tubo.

Ejemplo resuelto

Para 10 reacciones de 25 µL con 10% extra (11 reacciones preparadas): tampón 10X 2.500 µL, dNTP 10 mM 0.500 µL, cada cebador 10 µM 1.250 µL, polimerasa 5 U/µL 0.125 µL (0.625 U), molde 1 µL y agua 18.375 µL por reacción. El master mix es de 24 µL por tubo, 24 × 11 = 264.0 µL en total.

Fuentes: NEB — PCR with Taq DNA Polymerase (M0273), protocols.io · Lorenz TC. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting. J Vis Exp 2012;(63):e3998

Preguntas frecuentes

¿Cuánto master mix extra debo preparar?

Normalmente un 5–10% o una reacción extra por cada 10. Las enzimas en glicerol, que son viscosas, y los muchos pasos de pipeteo pierden más, así que para placas de 96 pocillos se suele preparar un 10% extra.

¿El molde va dentro del master mix?

No, salvo que todos los tubos lleven el mismo molde (por ejemplo, al probar varios pares de cebadores con una muestra). Lo normal es añadir el molde a cada tubo por separado, y el control sin molde recibe agua.

¿Qué concentración final de cebadores uso?

0.1–1 µM de cada cebador, habitualmente 0.2–0.5 µM. Concentraciones más altas aumentan los dímeros de cebadores y los productos inespecíficos; en qPCR con SYBR Green lo típico es 0.1–0.4 µM.

¿Necesito añadir MgCl₂?

La mayoría de los tampones estándar ya tienen 1.5–2 mM de MgCl₂. Añade más solo si el tampón no tiene magnesio o al optimizar (en pasos de 0.5 mM); si no, deja el MgCl₂ extra en 0.

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