Calculadora de rendimiento de PCR: copias y nanogramos después de n ciclos

Cómo funciona

N = N₀ × (1 + E)ⁿ, con un tope en la meseta; N₀ a partir de la masa = ng × Nₐ ÷ (pb del templado × 660 × 10⁹); masa = N × pb del amplicón × 660 g/mol ÷ Nₐ; ciclos para un objetivo = ⌈log(N_objetivo ÷ N₀) ÷ log(1 + E)⌉; techo por primers = [primer] × volumen × Nₐ; techo por dNTP = 4 × [dNTP] × volumen × Nₐ ÷ (2 × pb)

En la fase exponencial cada ciclo multiplica el blanco por (1 + E), donde E es la eficiencia de amplificación: 100% es una duplicación perfecta y las reacciones bien optimizadas trabajan entre 90 y 100%. Treinta ciclos al 100% multiplicarían el templado unas mil millones de veces (2³⁰ ≈ 1.07 × 10⁹). En la práctica la reacción deja de crecer de forma exponencial cuando se acumula producto: la polimerasa se vuelve limitante, las hebras de producto se reaparean en lugar de unir primers, y el pirofosfato y el ADN de doble cadena inhiben la enzima. El material de capacitación forense del NIJ sitúa el inicio de la meseta en unos 0.3–1 pmol de producto, que para un amplicón de 500 pb son unos 100–330 ng; a partir de ahí el crecimiento se frena, así que cerca de esa cantidad el rendimiento real puede quedar por debajo de la estimación exponencial. La calculadora limita el rendimiento al menor de tres techos: una concentración de meseta empírica (40 ng/µL por defecto, en Más opciones), los primers (cada dúplex de producto consume un primer directo y uno reverso) y los dNTP (dos nucleótidos por par de bases). Muestra el ciclo en que la banda se vuelve visible en el gel, el ciclo en que empieza la meseta, una revisión con ±5 puntos de eficiencia y la tabla completa por ciclo. Cambia a «Ciclos para un objetivo» para saber cuántos ciclos dan una cantidad dada, o escribe el templado como masa (plásmido o ADN genómico) en lugar de copias. El modelo es exponencial con un techo fijo; en la realidad la eficiencia baja poco a poco en los últimos ciclos antes de la meseta, así que toma como aproximados los ciclos cercanos a ella.

Ejemplo resuelto

Luis parte de 1,000 copias de un blanco de 500 pb con 95% de eficiencia en 25 µL. Un amplicón pesa 500 × 660 ÷ 6.022 × 10²³ = 5.48 × 10⁻¹⁰ ng (0.548 ag). Tras 30 ciclos tiene 1,000 × 1.95³⁰ = 5.02 × 10¹¹ copias, es decir, 275.3 ng (11.01 ng/µL, 33.37 nM). El techo de meseta es 40 ng/µL × 25 µL = 1 µg (1.82 × 10¹² copias), menor que los techos de primers (6.02 × 10¹²) y de dNTP (1.20 × 10¹³), así que la reacción sigue siendo exponencial. Una banda de 10 ng aparece en el ciclo 26 y la meseta empieza hacia el ciclo 32. Con 90% o 100% de eficiencia la misma corrida daría 126.3 ng o 588.4 ng.

Fuentes: NIJ forensic DNA amplification training: the plateau effect (0.3–1 pmol of product) · Omni Calculator – DNA copy number (660 g/mol per bp, N = i × 2ⁿ) · Calculator Academy – PCR cycle calculator (C = I × (1 + E)ⁿ, solve for cycles) · Gene-Quantification: causes of the PCR plateau (Kainz 2000)

Preguntas frecuentes