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Calculadora del grado de marcaje (relación fluoróforo/proteína)

Calcula el grado de marcaje (DOL, relación F/P) de un anticuerpo o proteína marcados con un fluoróforo a partir de la A280 y la absorbancia del colorante, con el factor de corrección y la concentración de proteína.

Fluoróforo

A280 del conjugado

Absorbancia en el máximo del fluoróforo (Amax)

ε del fluoróforo personalizado

Factor de corrección A280 personalizado

ε de la proteína a 280 nm

Peso molecular de la proteína

Factor de dilución de la muestra medida

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Cómo funciona

A280 corregida = A280 − Amax × CF · proteína (M) = A280 corregida × dilución ÷ ε proteína · fluoróforo (M) = Amax × dilución ÷ ε fluoróforo · DOL = fluoróforo (M) ÷ proteína (M) · proteína (mg/mL) = proteína (M) × PM

Después de conjugar un fluoróforo a un anticuerpo u otra proteína y eliminar el colorante libre, el grado de marcaje (moles de fluoróforo por mol de proteína) indica si la reacción funcionó. El colorante absorbe en su propio máximo (494 nm para Alexa Fluor 488, 650 nm para Alexa Fluor 647) y algo a 280 nm, por eso su aporte se resta de la A280 con el factor de corrección antes de cuantificar la proteína con la ley de Beer–Lambert. En IgG, un DOL de 2–10 es lo típico según el fluoróforo; si es bajo la tinción es tenue y si es muy alto aparece autoextinción y puede bajar la afinidad del anticuerpo. Los coeficientes de extinción y factores de corrección siguen los valores del fabricante (Thermo Fisher).

Ejemplo resuelto

Una IgG marcada con Alexa Fluor 488 da A280 = 1.2 y A494 = 0.9. A280 corregida = 1.2 − 0.9 × 0.11 = 1.101, así que la proteína = 1.101 ÷ 210,000 = 5.243 µM (0.786 mg/mL). El fluoróforo = 0.9 ÷ 71,000 = 12.676 µM, lo que da un grado de marcaje de 12.676 ÷ 5.243 = 2.42.

Fuentes: Thermo Fisher (Pierce) Tech Tip #31 — Calculate dye:protein (F/P) molar ratios · Thermo Fisher — Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit manual (ε and correction factor)

Preguntas frecuentes

¿Cuál es un buen grado de marcaje para un anticuerpo?

Normalmente 2–10 fluoróforos por IgG, a menudo 4–7 para colorantes verdes brillantes y 3–7 para los del rojo lejano. El óptimo depende del colorante y de la aplicación; un marcaje muy alto apaga la fluorescencia y puede bloquear la unión al antígeno.

¿Por qué necesito un factor de corrección?

La mayoría de los colorantes absorben algo de luz a 280 nm. Si no se resta (Amax × CF), la concentración de proteína se sobreestima y el DOL se subestima.

¿La relación F/P es lo mismo que el DOL?

Sí. La relación fluoresceína/proteína (F/P) es el término antiguo del marcaje con FITC; grado de marcaje (DOL) o grado de sustitución (DOS) son los nombres generales.

¿Qué hago si la absorbancia supera 2?

Diluye el conjugado para que las lecturas queden en el rango lineal del espectrofotómetro (unos 0.1–1.5), vuelve a medir y escribe el factor de dilución.

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Esta calculadora tiene fines informativos. Verifica los resultados importantes antes de tomar decisiones.